Fluorimetria: spettro 3D EEM e spettro di emissione
Esplora in modo interattivo una matrice eccitazione-emissione (EEM) didattica e ricava lo spettro di emissione alla lunghezza d’onda di eccitazione scelta.
Spettrofluorimetria: EEM 3D e spettro di emissione
Scegli un fluoroforo, osserva la matrice eccitazione-emissione e seleziona λexc dal grafico o inserendola direttamente. Il tool mostra la sezione di emissione corrispondente e l’efficienza relativa di eccitazione a quella lunghezza d’onda.
Filtra per gruppi strutturali / cromofori
Il filtro per gruppi serve a confrontare famiglie strutturali. Non predice quantitativamente uno spettro a partire dalla struttura.
Nella mappa 2D puoi toccare qualsiasi punto per scegliere λexc. Nella vista 3D tocca/clicca l’asse di eccitazione alla base della superficie.
Spettro di emissione alla λexc scelta
L’altezza della curva è riferita al massimo assoluto del fluoroforo: eccitando lontano dai massimi la sezione resta bassa, ed è il comportamento che si osserva allo strumento. Sotto la diagonale, cioè per λem minori della λexc, la curva è deliberatamente soppressa.
Come leggere la mappa
Una EEM contiene una serie di spettri di emissione acquisiti cambiando progressivamente la lunghezza d’onda di eccitazione. Nel grafico 3D l’asse di eccitazione identifica la scansione, l’asse di emissione la lunghezza d’onda osservata e altezza/colore rappresentano l’intensità relativa.
Nel simulatore la superficie molecolare è il prodotto di tre fattori, \(I = E \cdot F \cdot A\). Il profilo di eccitazione E dipende solo dalla λexc e quello di emissione F solo dalla λem: sono somme di bande gaussiane centrate sui massimi riportati nel database, ciascuna normalizzata sul proprio valore massimo. Il terzo fattore A attenua la regione con λem ≤ λexc, dove una EEM reale non contiene fluorescenza. È un modello visivo, non una ricostruzione dello spettro misurato.
Perché le bande non si fondono in un’unica gobba
La larghezza delle gaussiane non supera la spaziatura fra i massimi elencati per quel fluoroforo. Senza questo vincolo i massimi vibronici ravvicinati dei sistemi aromatici condensati — antracene, pirene, perilene — verrebbero smussati in un unico rilievo, e il grafico cancellerebbe proprio l’informazione che il dato porta con sé. Per i fluorofori con un solo massimo di emissione la banda resta una gaussiana semplice.
Perché compaiono diagonali nella EEM reale?
La luce diffusa elasticamente produce una banda di Rayleigh vicino a λem = λexc; può comparire anche un secondo ordine vicino a λem ≈ 2λexc. Il tool può mostrarle per aiutare a riconoscerle, ma le tiene separate dal contributo fluorescente simulato. Sotto la diagonale, invece, non si simula nulla: emissione a lunghezza d’onda minore di quella di eccitazione richiederebbe energia che il fotone assorbito non ha, e quella regione di una EEM vera contiene soltanto luce diffusa.
Gruppi strutturali e fluorescenza
Coniugazione, rigidità e sistemi aromatici estesi possono favorire la fluorescenza, mentre sostituenti, protonazione, solvente e ambiente possono spostare o spegnere l’emissione. Il filtro strutturale serve a confrontare esempi del database: non esiste qui una regola che trasformi un elenco di gruppi funzionali in uno spettro quantitativo.
Limiti del modello
Il database riporta i massimi, non la forma reale delle bande: intensità relative, asimmetrie e code sono ricostruite, non misurate. L’efficienza relativa di eccitazione descrive la posizione della λexc rispetto ai massimi di assorbimento, non la resa quantica né l’assorbanza. Solvente, pH e temperatura indicati nella scheda sono le condizioni della fonte: cambiandoli, in laboratorio, cambiano anche i massimi.