Spettrofotometria UV-Vis: Beer-Lambert e curva di calibrazione
Spettrofotometria UV-Vis: Beer-Lambert e curva di calibrazione
Un simulatore didattico per collegare spettro, lunghezza d’onda, cuvetta, assorbanza, trasmittanza e retta di calibrazione come si fa al banco di laboratorio.
1. Scegli il sistema e la lunghezza d’onda
2. Beer-Lambert
3. Spettro didattico e scelta di λ
La linea continua è una ricostruzione didattica centrata sui massimi documentati del preset. Fai clic sul grafico per scegliere una nuova lunghezza d’onda.
4. Curva di calibrazione
Se lasci vuote le assorbanze misurate, il tool genera la serie ideale dalla legge di Beer-Lambert. Per inserire valori multipli usa sempre il punto e virgola ; come separatore.
Le relazioni usate
Per radiazione monocromatica e soluzione omogenea, la forma più usata della legge di Beer-Lambert è:
\[ A = \varepsilon\,b\,c \]
dove A è l’assorbanza, ε il coefficiente di assorbimento molare, b il cammino ottico e c la concentrazione.
Assorbanza e trasmittanza sono collegate da:
\[ A=-\log_{10}(T), \qquad T=\frac{I}{I_0}=10^{-A} \]
Perché scegliere la lunghezza d’onda giusta
In una misura quantitativa si lavora spesso vicino a un massimo di assorbimento perché la sensibilità è maggiore. Il massimo adatto dipende però dalla specie chimica, dal solvente, dal pH e dalla matrice. I preset del tool riportano per questo anche le condizioni a cui si riferiscono.
Il colore del raggio nello schema è una rappresentazione didattica: nel visibile segue approssimativamente la lunghezza d’onda selezionata; nell’UV e nel vicino IR viene usato un colore convenzionale per rendere visibile sullo schermo una radiazione che l’occhio non vedrebbe.
Perché in UV si usano cuvette di quarzo
Il materiale della cuvetta deve trasmettere nella regione spettrale in cui si effettua la misura. Il vetro ottico comune è adatto soprattutto al visibile; la silice fusa ad alte prestazioni può invece estendersi fino a circa 200 nm. Non esiste però un unico limite valido per ogni cuvetta: il valore reale dipende dal materiale e dal prodotto.
Come riferimento didattico, il catalogo Hellma indica 200–2500 nm per quarzo ad alte prestazioni QS, 260–2500 nm per quarzo UV, 330–2500 nm per borosilicato BF e 360–2500 nm per vetro ottico OG. Alcune cuvette monouso UV in plastica sono dichiarate dal produttore per 230–900 nm, mentre esempi in PMMA sono indicati da 300–900 nm. Il tool usa questi intervalli solo per generare un avviso: per una misura reale fa fede la scheda tecnica della cuvetta usata.
Il cammino ottico standard è spesso 10 mm = 1 cm, ma è un parametro della misura e non va dato per scontato. Nel tool è quindi modificabile e compare direttamente nell’equazione di Beer-Lambert.
Buone pratiche con le cuvette
- Non toccare con le dita le finestre ottiche attraversate dal fascio.
- Eliminare gocce, residui e bolle nel percorso ottico.
- Inserire la cuvetta con le finestre ottiche nella direzione corretta e mantenere l’orientamento nelle misure comparative.
- Usare un blank coerente con solvente, matrice e tipo di cuvetta del campione.
- Per misure quantitative reali verificare sempre intervallo spettrale e cammino ottico dichiarati dal produttore.
Curva di calibrazione
La modalità calibrazione può usare assorbanze misurate realmente oppure generare una serie ideale. Nel primo caso esegue una regressione lineare ordinaria e restituisce pendenza, intercetta e \(R^2\). La concentrazione dell’incognito viene ricavata dall’equazione della retta, non direttamente da \(A=\varepsilon bc\).
Quando la legge di Beer-Lambert può non bastare
La linearità può peggiorare per concentrazioni elevate, equilibri chimici dipendenti dalla concentrazione, associazione o dissociazione della specie assorbente, scattering, luce parassita, banda spettrale troppo larga rispetto alla struttura dello spettro o problemi di blank e cuvetta. Il tool segnala condizioni numeriche estreme, ma non può sostituire la verifica sperimentale della linearità dello strumento e del metodo.